慢性炎症是肥胖症、炎症性肠病、心血管疾病等多种慢性病的“共同土壤”‌。来源于天然成分的抗炎肽因其对健康的积极改善作用和较高的安全性，已成为研究热点。灵芝是一种名贵食药用真菌，具有增强免疫力、抗肿瘤、抗氧化等多种功效。已有研究发现灵芝来源的活性肽具有抗高血压、抗氧化、抗癌等潜力，但其抗炎活性及分子机制研究尚不清楚。

我院微生物生理代谢与绿色发酵团队，围绕上述科学问题，前期从灵芝菌丝体上清液中发现一个具有优异抗氧化活性的五肽GLP4，在此基础上，进一步探究了其抗炎活性，并解析了其分子靶点。成果以“GLP4, a peptide from Ganoderma lingzhi directly targeting TBK1 to exert anti-inflammatory activity”为题，近日发表在农林领域一区Top期刊Food Science and Human Wellness（博士研究生黄萍为论文第一作者，王晓玲副教授和刘高强教授为通讯作者）。Food Science and Human Wellness是中国率先创刊的食品科技类全英文SCI期刊（IF 7.3），2019年入选中国科技期刊卓越行动计划高起点新刊类项目，2026年入选世界一流科技期刊。中科院分区和新锐分区均为农林大类一区Top期刊。

主要结果简介：

1. 灵芝肽GLP4具有显著抗炎活性‌：在脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞炎症模型中，GLP4处理能显著抑制炎症因子IL-1β（图1B）、TNF-α（图1C）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）（图1D）和IL-6（图1E）的mRNA表达水平。Western blot结果进一步证实，GLP4预处理能显著降低环氧合酶-2（COX-2）、iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表达水平（图1F）。这些结果表明GLP4具有显著的抗炎活性。

图1 GLP4的抗炎活性。(A) GLP4对Raw264.7细胞的细胞毒性。(B) IL-1β mRNA的表达水平。(C) TNF-α mRNA的表达水平。(D) iNOS mRNA的表达水平。(E) IL-6 mRNA的表达水平。(F-G) 通过蛋白免疫印迹检测Cox-2、IL-6、IL-1β、iNOS和TNF-α的蛋白表达。注：与对照组比较，* P < 0.05，** P < 0.01。与LPS组比较，# P < 0.05，## P < 0.01。

‌ 2. GLP4在细胞内的分布：荧光观察和流式细胞术分析显示，GLP4能够被巨噬细胞特异性摄取并进入细胞质，且其摄取呈浓度依赖性（图2）。这为GLP4在细胞内发挥作用提供了基础。

图2 RAW264.7 细胞中 GLP4 的分布。(A) RAW264.7 细胞孵育 24 小时后的代表性荧光图像。DAPI（蓝色）染核，FITC（绿色）表示 GLP4 的定位。Blank：空白对照组；GLP4：GLP4 组（50 μg/mL）。(B) 各组的荧光直方图分布及平均荧光强度由流式细胞仪测定。注：与 0 μg/mL 组比较，* P < 0.05, ** P < 0.01。比例尺=2 μm。

‌ 3. GLP4的靶蛋白鉴定‌：通过生物素标记的GLP4（Bio-GLP4）进行Pull down实验，结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定，发现并验证了TANK结合激酶1（TBK1）是GLP4的关键结合蛋白（图3）。TBK1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在NF-κB等炎症信号通路中处于关键位置。

图3 GLP4蛋白靶点的识别与验证。(A) 由生物素-GLP4识别出的潜在靶蛋白的示意图。(B) Pull down实验后的银染示意图。(C) Pull down实验后TBK1的免疫印迹验证。(D) 荧光显微镜显示TBK1（红色）与Fitc-GLP4（绿色）荧光的重叠。(E) GLP4结合外源性TBK1。比例尺 = 50 μm。

‌ 4. GLP4与TBK1的相互作用研究‌：分子对接显示GLP4能进入TBK1蛋白的活性口袋，主要通过氢键相互作用，结合能为-7.9 kcal/mol（图4A-B）。分子动力学模拟（100 ns）的均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）和回转半径（Rg）分析表明，GLP4-TBK1复合物结构稳定（图4C-E）。此外，表面等离子体共振（SPR）实验实时测定了GLP4与TBK1的结合动力学，其平衡解离常数（KD）为0.368 μmol/L，表明两者之间存在高亲和力结合。多光谱结果显示，GLP4与TBK1结合后，导致TBK1的二级结构发生显著变化，α-螺旋含量减少，β-折叠和无规卷曲含量增加，提示结合影响了TBK1的构象。

图4 GLP4与TBK1的相互作用评估。(A) GLP4-TBK1分子对接的三维图；(B) GLP4-TBK1复合物的作用位点和键长分析；RMSD (C)、RMSF (D) 和 Rg (E) 的分子动力学模拟。

‌ 5. GLP4通过靶向TBK1抑制NF-κB通路‌：Western blot结果表明，GLP4并不影响TBK1的总蛋白表达，但能显著抑制LPS诱导的TBK1磷酸化（图5A）。由于TBK1参与NF-κB通路的激活，进一步检测发现GLP4处理也抑制了NF-κB的活化（图5B）。这表明GLP4可能通过结合TBK1，抑制其激酶活性，进而下调NF-κB信号通路，发挥抗炎作用。

图5 GLP4 对 TBK1、NF-κB 的影响。(A) TBK1 和 p-TBK1 的西方印迹分析；(B) p-TBK1 的相对蛋白表达；(C) p65 和 p-p65 的免疫印迹分析；(D) p-p65 的相对蛋白表达。注：与 Con 组相比，* P < 0.05，** P < 0.01。与 LPS 组相比，# P < 0.05，## P < 0.01。

‌ 结论：本研究报道了真菌灵芝来源的活性肽GLP4通过直接靶向TBK1发挥抗炎作用。GLP4能有效抑制巨噬细胞中炎症因子的表达，其与TBK1具有稳定的高亲和力结合，并可能通过抑制TBK1磷酸化及下游NF-κB通路活化来减轻炎症反应。该研究为灵芝肽的抗炎机制提供了分子层面的见解，并为开发基于天然产物的抗炎功能性食品或药物先导化合物提供了理论依据。