灵芝（Ganoderma lingzhi）是传统名贵食药用大型真菌，三萜类次级代谢物是灵芝的关键药效成分；灵芝三萜的生物合成调控机制是需要解决的重要科学问题。前期已发现活性氧，钙信号及磷脂酶D（PLD）介导脂信号分子磷脂酸（PA）等参与调控灵芝三萜生物合成（Liu YN, et al., Environmental Microbiology, 2017；Liu YN, et al., Mycologia，2019），但这些信号分子的下游信号，以及直接调控灵芝三萜生物合成的转录因子尚不清楚。

我院微生物生理代谢与绿色发酵团队，从转录因子SREBP着手，通过灵芝全基因测序与解析、DNA亲和纯化测序和EMSA等技术，揭示了SREBP直接调控灵芝三萜合成的靶基因；通过RNA-Seq和代谢组学，结合遗传学和分子生物学方法，阐明了转录因子SREBP直接调控灵芝三萜和脂质生物合成的分子机制。成果以“The bHLH-zip transcription factor SREBP regulates triterpenoid and lipid metabolisms in the medicinal fungus Ganoderma lingzhi”为题，作为期刊2023年第1篇论文发表在Nature旗下期刊《Communications Biology》（中科院 生物学1区Top）。刘勇男副教授为论文第一作者，刘高强教授为通讯作者。

▲转录因子SREBP调控灵芝三萜和脂质合成机制示意图及在线发表截图

基于前期已发现的PLD介导PA参与调控灵芝三萜生物合成，以及已揭示的转录因子SREBP调控灵芝三萜生物合成的分子机制，团队进一步采用PA-beads串联LC-MS/MS技术，GST-pull down和免疫共沉淀串联脂质组学，揭示了PA与mTOR蛋白互作，并通过构建基因突变体，运用WB，EMSA和靶向三萜代谢组等技术，阐明了PLD介导的PA通过直接激活mTOR蛋白，进而促进SREBP激活三萜合成靶基因转录，从而调控热诱导的灵芝三萜合成的信号转导通路。成果以“Phosphatidic acid directly activates mTOR and then regulates SREBP to promote ganoderic acid biosynthesis under heat stress in Ganoderma lingzhi”为题，再次发表在Nature旗下生物学期刊《Communications Biology》。刘勇男副教授为论文第一作者和通讯作者，刘高强教授为通讯作者。

▲图 模式图展示PLD、PA、mTOR和SREBP调控热诱导灵芝三萜生物合成的分子机制

主要结果和图表:

研究采用DAP-Seq技术，全基因组范围鉴定了SREBP互作DNA，找得了1144个SREBP潜在调控靶基因，并采用EMSA验证了10个靶基因启动子DNA与SREBP蛋白互作。构建灵芝SREBP过表达菌株，Western-blot分析显示，过表达菌株中SREBP蛋白水平显著上调，并且细胞核形式的SREBP蛋白含量显著增加。转录组分析发现，过表达SREBP菌株中有2152个显著上调基因，其中177个是SREBP靶基因。过表达SREBP导致显著上调基因富集在三萜骨架、固醇、甘油脂和磷脂合成等代谢通路，采用qRT-PCR验证了与三萜和脂质合成相关且显著上调的SREBP靶基因；并且，过表达SREBP中上调的靶基因可以通过外源添加SREBP抑制剂Fatostatin恢复到野生型菌株水平。靶向三萜和脂质代谢组分析发现，与野生型菌株相比，SREBP过表达菌株中三萜合成中间代谢产物3,5-二羟基-3-甲基戊酸和羊毛甾醇以及17种灵芝三萜类化合物显著上调，多种甘油脂、甘油磷脂以及鞘脂含量显著提高，并且这些代谢物的上调，可以通过向SREBP过表达菌株中添加Fatostatin去除（图1）。

图1 SREBP调控灵芝三萜和脂质合成机制研究主要结果

采用PA-beads串联LC-MS/MS，鉴定了灵芝细胞中PA互作蛋白；进一步采用GST-pull down和免疫共沉淀串联脂质组学，证明PA分子，特别是34:0-PA，34:1-PA，34:2-PA，36:2-PA和36:3-PA，可与mTOR蛋白的FRB结构域在胞内和胞外互作（图2）。

▲图2 PA与mTOR蛋白互作鉴定

通过构建基因突变体，运用WB，EMSA和靶向三萜代谢组等技术，发现沉默PLD，mTOR和SREBP抑制了热诱导的灵芝三萜代谢物，添加mTOR抑制剂Rapa和PLD抑制剂1-but对SREBP沉默菌株的三萜合成没有影响。并且沉默SREBP不能抑制mTOR活性，但SREBP沉默菌株中的mTOR活性可以被mTOR抑制剂Rapa和PLD抑制剂1-but去除（图3）。

▲图3 SREBP位于PLD和mTOR蛋白下游调控灵芝三萜合成

综上，该研究阐明了PLD介导的PA通过与mTOR互作并激活mTOR活性，进而促进转录因子SREBP激活三萜合成靶基因转录，从而调控灵芝三萜合成的信号转导通路。

该研究工作得到了国家自然科学基金（31900027和32471816），湖南省科技创新团队项目（2021RC4063），湖湘青年英才（2023RC3157）等项目资助。在读研究生陈宇琳（硕），张紫娟（博），王浩锦（博），刘必扬（博）及王晓玲副教授，以及已毕业生伍逢源（硕）和田人元（本科）等参与了该研究工作。

全文链接：

https://rdcu.be/dZ89M（2024, Commun Biol）

https://rdcu.be/c2GyG（2023, Commun Biol）